| 人iPS細胞基因編輯解決方案，Disease model in a dish | ||||||||||
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| ■ 關鍵操作之基因編輯人iPS細胞 | ||||||||||
| CRISPR/Cas9基因編輯技術的兩個組件（Cas9核酸酶和sgRNA）可以通過多種方法導入至靶細胞，如載體表達系統，RNA轉染系統，或直接導入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)復合物(Sander and Joung 2014)。與載體表達系統相比，直接導入Cas9/sgRNA RNPs更加快速，同時脫靶效應的可能性更小 (Kim et al. 2014)。 |
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| 對于難轉染的人iPS細胞，Takara提供兩種Cas9/sgRNA RNPs導入方法，電穿孔Electroporation法或納米囊泡Gesicle法，實現高效的、低脫靶效應的基因編輯。 | ||||||||||
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| 一、電穿孔法基因編輯 · Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 1 kit) · Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready) (Code No. 632641; 100 μg) 二、Gesicle法基因編輯 · Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code No. 632613；1 kit) |
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| ■ 關鍵操作之獲得所需突變的單細胞克隆 | ||||||||||
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| 一旦Cas9/sgRNA RNP復合物被導入, 為了分離和篩選感興趣的基因型，需要進一步分離成單細胞并擴增為單克隆。傳統的人iPS 細胞以集落狀生長和傳代，不利于進行單細胞分離和單細胞培養，為基因編輯后建立單克隆增加了難度。 |
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| Takara旗下的DEF-CS™ 培養系統（Asplund et al. 2016），支持人多能干細胞無血清，無飼養層，單層均勻、非集落狀生長，規避了集落狀生長帶來的挑戰，允許單細胞傳代和促進接種后的單細胞存活和擴增，更利于獲得基因編輯后感興趣突變的單克隆。建議使用Y30010進行人iPS細胞常規培養，使用Y30021進行人iPS細胞單克隆培養。 |
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| 參考文獻： | ||||||||||
| · Asplund, A. et al. One Standardized Differentiation Procedure Robustly Generates Homogenous Hepatocyte Cultures Displaying Metabolic Diversity from a Large Panel of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. Reports 12, 90–104 (2016). · Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J. & Kim, J.-S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012–9 (2014). · Sander, J.-D. & Joung, J.-K. CRISPR-Cas9 systems for genomic editing, regulation and targeting. Nat. Biotechnol. 32, 347–55 (2014). |
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| 實驗案例： | ||||||||||
| 1. 在人iPS細胞的內源性基因插入AcGFP1標簽 Tagging an endogenous gene with AcGFP1 in hiPS cells |
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| 2. 在人iPS細胞內源性基因插入myc標簽 Tagging an endogenous gene with a myc tag in hiPS cells |
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| 3. 人iPS細胞敲除內源性基因CD81 Knocking out an endogenous gene (CD81) in hiPS cells |
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| 4. 在人iPS細胞內引入酪氨酸血癥相關SNP Introducing a tyrosinemia-related SNP in hiPS cells |
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| 5. 在人iPS細胞的AAVS1位點插入表達框 Inserting an expression cassette into the AAVS1 locus in hiPS cells |
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| 6. 使用電穿孔法編輯人iPS細胞 Editing hiPS cells using electroporation |
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| 7. 建立人iPS細胞的單細胞克隆 Single-cell cloning of hiPS cells |
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