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          qPCR技術介紹(一)——基礎概念
           
          Real Time PCR,即實時熒光定量PCR,也被稱為定量PCR或qPCR,是實時監測PCR擴增產物并進行解析的方法。
          由于定量PCR具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優點,被廣泛應用于醫學檢測、藥物療效考核、基因表達研究、轉基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品檢測等各種領域。
          所以,無論您從事生命科學的基礎研究,還是制藥企業、畜牧養殖企業、食品企業的從業人員,乃至出入境檢驗檢疫局、環境監測部門、醫院等單位的員工,都會或多或少地接觸到或者需要了解掌握定量PCR的知識。
           
          Real Time PCR的原理
           
          Real Time PCR,是在PCR反應體系中加入熒光物質,并通過定量PCR儀器,對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測,最終對實驗數據進行分析處理的方法。
           
          【擴增曲線】即描述PCR動態進程的曲線。PCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數曲線,而是S形曲線。
           
          【擴增曲線的平臺期】隨著PCR循環數的增加,DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭、反應副產物焦磷酸對合成反應的阻害等原因,致使PCR并非一直呈指數擴增,而最終將進入平臺期。
           
          【擴增曲線的指數增長區】盡管平臺期的變化很大,但在擴增曲線的指數增長區的某一區域,重復性非常好,這對PCR的定量分析非常重要。
           
          【閾值和Ct值】我們在擴增曲線的指數增長區適當位置設定熒光檢出界限值,即閾值(Threshold)。閾值與擴增曲線的交點就是Ct值,也就是Ct值是指達到閾值時的循環圈數(Threshold Cycle)。
           
          下圖清晰地顯示了閾值線與擴增曲線、閾值與Ct值之間的關系。
           
          如何定量?
          經數學理論證明,Ct值與起始模板數的對數值成反比線性關系。Real Time PCR實時監控PCR擴增產物,在指數擴增期進行定量。PCR每進行1個循環,DNA呈2倍的指數關系增長,不久達到平臺期。
           
          假設起始DNA的量為A0,經過了n個循環后,理論上DNA產物的量可以表示為:
          An=A0×2n
           
          那么,起始DNA量A0越多,擴增產物的量便越早達到檢出值An,達到An時的循環圈數即Ct值。也就是起始DNA量A0越多,擴增曲線越早起峰,對應需要的循環圈數n越小。
           
          我們將已知濃度的標準品進行梯度稀釋,作為模板進行Real Time PCR,就會按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。根據Ct值與起始模板數的對數值之間的線性關系,就可以制作出【標準曲線】。
           
          未知濃度的樣品的Ct值代入標準曲線,就可以求出未知濃度樣品的起始模板量,這就是Real Time PCR的定量原理。
           
          Real Time PCR的檢測方法
          Real Time PCR是通過檢測反應體系中的熒光強度來檢測PCR擴增產物的,其熒光檢出方法可分為熒光染料嵌合法和熒光探針法兩大種類。
           
          熒光染料嵌合法的原理
          熒光染料,如TB Green®,可以與PCR體系中的雙鏈DNA非特異性結合,結合后會發出熒光。
          隨著PCR循環圈數的增加,反應體系中的熒光強度呈指數增加。通過檢測熒光強度,可以實時監測反應體系中的DNA擴增量,進而反推算樣本中的起始模板量。
           
          熒光探針法的原理
          熒光探針,如TB Green®是5'端帶有熒光基團,3'端帶有淬滅基團的一段核酸序列,可以與模板特異性結合。當探針完整時,熒光基團發射的熒光被淬滅基團淬滅,不能發出熒光。而當探針被分解后,熒光物質會游離出來,發出熒光。
           
          PCR反應液中加入了熒光探針,在退火過程中,熒光探針便會和模板的特異位置結合。延伸過程中,PCR酶的5'→3'外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針,熒光物質游離處理,發出熒光。通過檢測反應體系中探針的熒光強度,可以達到監測PCR產物擴增量的目的。
           
          熒光檢測方法的選擇
          如果用于區別同源性高的序列,以及進行SNP分型解析等多重PCR檢測,熒光探針法無可替代。
          而進行除此之外的Real Time PCR實驗,可以使用簡單易行、成本低的熒光嵌合法。
            染料法 探針法
          優點   簡單易行,成本較低,無需合成特異性探針   特異性強,能進行多重PCR
          缺點   對擴增的特異性要求高;不能進行多重PCR   需要設計特異性探針,成本較高;有時探針設計困難
           
           
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                  頁面更新:2023-03-30 16:31:34