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          機構用戶解決方案

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          技術服務信息

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          無標題文檔
           
          qPCR技術介紹(二)——RNA提取&反轉錄
           
          一般進行定量PCR的目的,是為了進行mRNA的表達量分析,或者對RNA拷貝數進行定量,或者確定RNA病毒是否存在的定性分析,那么首先都需要進行反轉錄實驗,將RNA反轉錄為cDNA。
          本文為您介紹反轉錄實驗相關的一些基礎概念。
           
          RNA模板
           
          RNA操作的注意
          制備RNA的關鍵,一是要抑制細胞中的RNA分解酶,二是要防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。
          在實驗中必須采取以下措施:戴一次性干凈手套;使用 RNA 操作專用實驗臺;在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
           
          【使用器具】盡量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,應在使用前進行干熱滅菌(180℃,60 min)或使用DEPC水處理再高壓滅菌。 RNA實驗用的器具和儀器建議專門使用,不要用于其它實驗。
           
          【試劑配制】用于RNA實驗的試劑,需使用RNA實驗用的一次性塑料容器盛裝,或使用上面方法處理過的玻璃容器盛裝。使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后進行高溫高壓滅菌。RNA實驗用的試劑和無菌水都應專用,避免混用后交叉污染。
           
          RNA模板的質量
          RNA的純度會影響cDNA的合成量,所以在提取RNA后需要進行RNA純度和質量檢測。
           
          吸光度測定方法

          260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白質等有機物的吸光度值。
          OD260/OD280(R)體現了RNA中的蛋白質等有機物的污染程度,質量較好的RNA的R值應在1.8~2.0之間。當R< 1.8時,溶液中的蛋白質等有機物的污染比較明顯;當R>2.2時,說明RNA已經被水解成了單核苷酸。
          在對核酸進行吸光度檢測時,需要注意稀釋液應使用TE Buffer。
          根據OD260,可以計算提取的RNA濃度:
          RNA濃度(μg/μL)= (A260-A320)×稀釋倍數×0.04
           
          凝膠電泳方法

          利用1%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)電泳結果,對提取的Total RNA進行RNA完整性以及是否有基因組DNA污染的評價。
           
          如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶(真核生物:28S和18S;原核生物:23S和16S),且其濃度比值大約為2:1,則RNA未降解。
           
          若觀察到smear現象,則RNA已發生降解。
           
          如果觀察到大于28S或23S的條帶,則樣品可能有基因組DNA污染,這時可以考慮使用DNase I處理。
           
          使用Agilent 2100 BioAnalyzer進行檢測

          本方法基于微流體技術,僅需要2-7 ng RNA用于分析,可以替代傳統的基于凝膠的分析方法。通過RNA Integrity Number (RIN)評估RNA樣品的完整性。除了評價RNA質量外,這個自動化系統還可以很好地提供RNA濃度的估計值。
           
          反轉錄引物
           
          反轉錄引物的選擇
          進行Two Step RT-PCR反應時的反轉錄Primer,可使用Random Primer、Oligo dT Primer或Gene Specific Primer三種引物,它們與RNA模板互補結合的位置關系如圖所示,我們必須根據實驗目的區分使用。
           
          Random Primer

          通?;虮磉_解析,Random Primer最適合。Random Primer能夠在mRNA全長范圍內進行高效率反轉錄,所以目的片段在mRNA的任何位置都能很好地進行表達解析。
           
          Oligo dT Primer

          想從Poly (A) 尾開始反轉錄反應時,使用Oligo dT Primer。但是如果目的片段距離Poly (A) 尾過遠,反轉錄效率將會降低。從Poly (A) 尾至目的片段擴增位置之間存在強二級結構或mRNA有分解可能的時候,使用Oligo dT Primer要特別注意。
           
          Gene Specific Primer

          進行One Step RT-PCR反應時,反轉錄引物只能使用基因特異性下游引物,而不能使用Random Primer和Oligo dT Primer。
          利用Real Time RT-PCR進行基因表達解析時,將Random Primer和Oligo dT Primer混合使用效果更佳,不僅可以在mRNA全長范圍內高效率反轉錄,還可以將mRNA二級結構及mRNA分解的影響控制在最小限度。
           
          排除基因組DNA的影響
          RNA模板中混入基因組DNA的處理
          提取的Total RNA中常?;煊谢蚪MDNA,而基因組DNA可以直接作為PCR模板進行擴增,造成解析結果不準確。
          為了避免這種情況發生,我們可以采取兩種措施:① 引物設計時避免基因組DNA擴增;② 使用DNase I 處理除去基因組DNA。
           
          引物設計時避免基因組DNA擴增
          首先確認目的基因的基因組結構,選擇跨越較長的內含子。然后,在這個內含子兩側的外顯子上分別設計上、下游引物。
          Real Time PCR反應時通常擴增的目的DNA片段長度都比較短,設置的條件也是適合短片段DNA的擴增,超過500 bp就很難擴增了。所以,當內含子足夠長時,基因組DNA來源的擴增就不能發生。
          當內含子較短時,可將其中一條引物設計在exon junction上,這樣,基因組DNA來源的擴增也不能發生。但是,此種方法不適合具有單個外顯子的基因、或者不具有內含子的生物種以及基因組情報沒被解析的生物種等。
           
          使用DNase I 處理除去基因組DNA
          使用常規方法提取Total RNA后,再使用DNase I 分解混入的基因組DNA,最后進行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等純化Total RNA?;蛘呤褂媚苋コ蚪MDNA的反轉錄試劑進行反轉錄反應。Takara明星產品PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Code No. RR047)是可以除去基因組DNA的定量PCR專用反轉錄試劑,試劑盒中附帶gDNA Eraser,僅需42℃、2分鐘即可高效去除基因組DNA。
           
           
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                  頁面更新:2023-03-30 16:31:20