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          qPCR技術介紹(三)——PCR反應
           
          PCR引物/探針的設計原則
          引物設計的優劣,是影響定量PCR實驗結果的重要因素之一。有些引物反應性能差,可以通過反應條件優化得到改善,但大多數情況改善效果并不是很明顯,所以,預先設計反應性能良好的引物尤為重要。
           
          qPCR引物設計原則
           
          除此之外,引物的長度、擴增片段長度以及基因組結構等參數都要加以考慮,下表總結了引物設計原則,號表示重要程度,號越多,表示該參數越重要,設計時要優先考慮。
           
          采用熒光探針檢測法時,要同時考慮引物和探針的質量。通常首先要尋找合適的探針位置,再進行引物的設計,然后再將引物和探針之間進行比對分析,應該說設計上比采用熒光嵌合法更加困難和繁瑣。下表總結了探針設計原則,號表示重要程度,號越多,表示該參數越重要,設計時要優先考慮。
           
          通??梢允褂靡镌O計專用軟件進行引物、探針的設計,如Primer Premier、Oligo 7等,也可以利用NCBI網站功能,無需下載軟件也可進行設計,并可以進行特異性的比對。
           
          如果想省去自己設計引物的繁雜操作,在Takara合成qPCR引物/探針,Takara可以免費提供引物/探針的設計服務。
           
          預實驗確認引物性能
          新設計合成的引物,首先必須進行預實驗,對反應性進行確認。
           
          模板使用梯度稀釋的cDNA溶液即可,每個反應加入相當于Total RNA 1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng的cDNA,對PCR擴增效率、檢測靈敏度、無模板對照和gDNA來源的擴增4個方面進行確認。
           
          如果預實驗顯示,PCR擴增效率低或有引物二聚體等非特異性擴增時,需要對PCR條件進行優化,優化可以按下圖的順序進行。
           
          如果條件優化后結果仍無改善,必須重新設計引物。
           
          一步法與兩步法的選擇
          qPCR常用于對樣本中的DNA或RNA進行定量,在對RNA進行定量的時候,需要先進行反轉錄反應(RT反應),將RNA反轉錄為cDNA。
           
          Two Step RT-PCR反應是將反轉錄反應和qPCR反應分兩步進行;One Step RT-PCR的反轉錄反應和PCR反應在同一反應管內連續進行。
           
          Two Step RT-PCR反應,可選擇Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特異性引物進行反轉錄反應,然后再將一部分反轉錄反應液(cDNA)作為模板添加到Real Time PCR反應液中。使用反轉錄引物時可以根據實驗目的選擇最合適的反轉錄引物,如果選擇Random Primer或Oligo dT Primer,合成的cDNA可用于復數種類基因的檢測,cDNA溶液可以穩定地長期保存,供以后解析使用。
           
          One Step RT-PCR的反轉錄反應和PCR反應在同一反應管內連續進行,操作簡單,污染幾率低。反轉錄反應需要使用基因特異性引物 (GSP),即基因特異性PCR下游引物,因此,能夠對特定基因進行高感度檢出。
           
          如何選擇
          以前,Two Step RT-PCR的反應性能占有優勢,但近些年來由于對試劑盒的不斷改良,One Step RT-PCR也能夠實現良好的反應性能。
          究竟采用何種方法,可根據實驗目的自由選擇。例如,病毒、病原菌檢測,適合使用操作簡單的One-Step RT-PCR方法;基因表達解析等目的基因數多時,適合使用通用引物的Two Step RT-PCR方法;樣品數多時,Two Step RT-PCR的操作顯得過于繁雜,而One Step RT-PCR就很方便。
          另外,One Step RT-PCR因使用基因特異性反轉錄引物,Total RNA的添加量即使很多,也能夠高效率反應,所以,有利于低表達基因的檢出。
           
           
           
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                  頁面更新:2023-03-30 16:30:56