<nav id="hjphs"></nav>

    <video id="hjphs"><center id="hjphs"></center></video>
  1. <u id="hjphs"><button id="hjphs"></button></u>
      <wbr id="hjphs"></wbr>

        <u id="hjphs"><sub id="hjphs"></sub></u>
      1. <optgroup id="hjphs"><strike id="hjphs"></strike></optgroup>

        <wbr id="hjphs"></wbr>
        <i id="hjphs"></i>
          我們使用cookie改善您的瀏覽體驗并提供有意義的內容。請閱讀我們的cookie協議
          收藏我們 在線訂購
               

          機構用戶解決方案

          產品選擇指南

          技術服務信息

          當前位置:首頁 > 熱點關注
          無標題文檔
           
          qPCR技術介紹(四)——數據解析篇
           
          定量的基本原理
          qPCR通過熒光信號值實時監控PCR擴增產物的變化,在指數擴增期進行定量分析。
          PCR每進行1個循環,DNA呈2倍的指數關系增長,不久達到平臺期。
          假設起始DNA的量為A0,經過了n個循環后,理論上DNA產物的量可以表示為:
          An=A0×2n
          那么,起始DNA量A0越多,擴增產物的量便越早達到檢出值An,達到An時的循環圈數即Ct值。也就是起始DNA量A0越多,擴增曲線越早起峰,對應需要的循環圈數n越小。
           
          理論上,Ct值與起始模板數的對數值成反比線性關系。
          我們將已知濃度的標準品進行梯度稀釋,作為模板進行Real Time PCR,就會按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。根據Ct值與起始模板數的對數值之間的線性關系,就可以制作出【標準曲線】。
          未知濃度的樣品的Ct值代入標準曲線,就可以求出未知濃度樣品的起始模板量,這就是qPCR的定量原理。
           
          標準曲線
          進行絕對定量,需要使用濃度已知的標準品來制作標準曲線。
          對qPCR引物進行性能驗證時,也需要制作標準曲線來判斷。
          下面就是如何選擇標準品,如何制作標準曲線,以及如何評價標準曲線的介紹。
          標準品的制備
          標準品要滿足以下條件:
          1. 濃度或拷貝數是已知的。
          2. 與實際檢測樣品間的擴增效率一致。
           
          如果待檢測的模板是基因組DNA,就要選擇基因組DNA作為標準品。但很難獲得目的基因濃度是已知的基因組DNA時,或者目的基因的豐度較低時,對于DNA起始的材料必須構建質粒。
          所構建的質粒標準品,不僅要具有目的序列,還要在目的序列的兩側各多加一段序列,使其更加接近實際檢測樣品的結構,以保持與實際檢測樣品間的擴增效率的一致性。
           
          進行mRNA表達解析時,最好選擇表達目的基因的Total RNA或以Total RNA為模板合成的cDNA作為標準品。但很難獲得目的基因濃度是已知的的Total RNA時,必須構建體外轉錄RNA。
           
          標準曲線的制作
          準備5~6個梯度稀釋的標準品


          將這些標準品作為模板進行Real Time PCR反應


          得到各濃度下的Ct值


          通過Ct值與起始模板濃度的對數值之間存在的線性關系,制作出標準曲線
           
          標準曲線的制作不需要人工操作,由儀器自動完成。
           
          理想的標準曲線
          評價標準曲線的優劣有兩個指標,相關系數(r2)和斜率(slope)。
          相關系數反映標準曲線的直線性,理想值應大于0.98,越接近于1說明直線性越好,定量越準確。
           
          斜率反映PCR擴增效率(E),PCR理想的擴增效率應在0.9<E<1.1范圍, 如果PCR擴增效率低時必須重新設計引物; 如果PCR擴增效率比理論值高時,說明反應體系中有可能存在對反轉錄反應或PCR反應的阻害物質,需要改進提取方法。
           
          融解曲線
          采用TB Green熒光嵌合法檢測時,可以通過融解曲線分析,確認PCR反應的特異性。
           
          融解曲線分析的原理
          PCR反應結束后,將PCR反應液的溫度漸漸升高,實時監測TB Green的熒光信號強度變化。
           
          起初,PCR擴增產物呈雙鏈,具有較高的熒光信號強度


          隨著溫度的漸漸升高,DNA雙鏈漸漸打開,嵌入DNA雙鏈中的TB Green數量減少,熒光信號強度就漸漸降低


          當雙鏈DNA解鏈一半時,熒光信號強度急劇下降,此時的溫度即融解溫度(Tm值)
           
          左圖為融解曲線的一次曲線,右圖為融解曲線的負一次微分曲線,通常使用融解曲線的負一次微分曲線進行分析的較多。
           
          Tm值與PCR擴增產物的序列有關,對于某一PCR擴增產物,其值是固定的。
          理想的融解曲線應該是只有單一峰型的曲線,如果出現兩個以上的峰型,說明有引物二聚體等非特異性擴增產生,需要對條件進行優化或重新設計引物。
           
           
          亚洲精品无码午夜在线观看_无码屋免费AV观看_日本高清专区一区二区_亚洲精品国产品国语在线
          <nav id="hjphs"></nav>

            <video id="hjphs"><center id="hjphs"></center></video>
          1. <u id="hjphs"><button id="hjphs"></button></u>
              <wbr id="hjphs"></wbr>

                <u id="hjphs"><sub id="hjphs"></sub></u>
              1. <optgroup id="hjphs"><strike id="hjphs"></strike></optgroup>

                <wbr id="hjphs"></wbr>
                <i id="hjphs"></i>

                  頁面更新:2023-03-30 16:30:45