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          qPCR技術介紹(五)——絕對定量與相對定量
           
          絕對定量 vs 相對定量
           
          定量方法可以區分為絕對定量和相對定量兩大種類。
          絕對定量是對未知樣品的絕對量(拷貝數)進行測定的方法。
          而相對定量,并不是測定基因的絕對量,而是分別測定目的基因和參比基因的量,再求出對于參比基因的目的基因的相對量,最后再進行樣品間相對量的比較。
          我們不能簡單地說絕對定量準確還是相對定量準確,而只能說它們的應用領域不同。絕對定量應用于病毒病原菌定量檢測、轉基因拷貝數分析、GMO定量分析等領域;相對定量主要應用于mRNA表達量解析,如果此時采用絕對定量的方法,就不能得到準確的解析結果。
           
          絕對定量
          絕對定量解析方法
          構建已知濃度的標準品
          (標準品制備相關介紹,請參考上一篇推送qPCR技術介紹(四)


          對標準品進行5~6個梯度稀釋


          標準品和待測樣品同時進行RT-qPCR或qPCR反應,得到Ct值


          儀器軟件根據輸入的標準品濃度和測得的Ct值,繪制標準曲線


          儀器根據待測樣品的Ct值在標準曲線上的位置,獲得待測樣品的濃度(或拷貝數)
           
           
          相對定量
          相對定量,一般是為了比較感興趣的目的基因,在不同的樣本中表達量的差異。
          那么如果通過前面介紹的絕對定量的方法,制作目的基因的標準曲線,再把幾個待測樣本中目的基因的Ct值帶入曲線,獲得目的基因的絕對量,再進行倍數關系比較,是否可以呢?
           
          引入參比基因的必要性
          不同的樣品,即使反應時使用相同量的Total RNA,但因細胞來源不同,RNA的總表達量并非一致。因此僅僅將反應時RNA量統一,起始的細胞數也不一定相同。而進行表達量比較時,不是RNA量相同,而是相同細胞數的RNA才是最重要的。
          實際上要將樣品材料(組織、細胞、菌體等)統一到相同細胞數提取,是非常困難的。
          同時還不能保證RNA提取效率完全相同、PCR擴增效率完全相同等。
          基于以上原因,利用Real Time RT-PCR方法進行基因表達解析,有必要選擇House Keeping Gene(管家基因)作為參比基因來對所有樣品進行歸一化處理(RNA量校正),然后再對不同樣品之間的目的基因表達量進行比較。
          分別測定不同樣本中目的基因和參比基因的量,再求出對于參比基因的目的基因的校正值,最后再進行樣品間校正值的比較。
           
          管家基因的選擇
          管家基因,是指所有細胞中穩定表達的一類基因,在qPCR中這類基因經常被選為參比基因,用來對所有樣品進行歸一化處理。
          以前,GAPDH、β-actin基因常被作為管家基因使用,但近幾年也常有這些基因因樣品經藥物等處理后表達量發生變化的報道。
          目前,很多研究者認為一種管家基因有可能校正不充分,同時使用兩個或兩個以上的復數管家基因進行校正更值得信賴。
          當然這種校正方法也是非常耗費精力的,通常要選擇若干個管家基因同時進行表達量分析,從中選擇表達量變化幅度小的管家基因來使用。
          選擇最適校正基因的軟件有很多,請下載利用(geNorm、BestKeeper等)。
           
          △△Ct法與雙標準曲線法
          相對定量解析大多采用標準曲線的定量方法,但也有不采取制作標準曲線的定量方法,如△△Ct方法等。
          01.標準曲線法
          需要分別制作管家基因和目的基因的標準曲線,儀器計算得到樣本的Ct值對應的定量值、校正值,進而得到校正值的比值,即樣本間表達量的差異。
          這種方法得到的相對表達量結果更接近實際情況。
          02.delta-delta Ct(△△Ct)法
          無需制作標準曲線,前提是假設管家基因和目的基因的擴增效率是100%。
          通過qPCR獲得目的基因和管家基因在不同樣本中的Ct值,以管家基因的Ct值為依據對目的基因進行差值校正,最終求得相對表達量。
          △Ct=目的基因Ct-參比基因Ct
          △△Ct=樣品A的△Ct-樣品B的△Ct
          表達量比值=2-ΔΔCt
          在擴增效率接近100%時,△△Ct法和標準曲線法得到的結果趨勢是一致的。
           
           
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                  頁面更新:2023-03-30 16:30:33